Биология - Футпринтинг ДНК - История
09 февраля 2011Оглавление:
1. Футпринтинг ДНК
2. История
В 1978 году Дэвид Галас и Альберт Шмитц разработали метод футпринтинга ДНК для изучения специфичности связывания белка-репрессора с лактозным опероном. Метод футпринтинга был основан на методе секвенирования Максама-Гилберта.
Метод
Рисунок 1. Схема эксперимента по футпринтингу ДНК
Наиболее простым применением данного метода является установление того, связывается ли белок с тем или иным районом ДНК.
- При помощи полимеразной цепной реакции амплифицируют и метят необходимую последовательность ДНК, которая является вероятным сайтом связывания белков. Идеальный размер ампликона в таком случае составляет от 50 до 200 оснований
- Добавляют исследуемый белок, при этом часть ДНК оставляют интактной для последующего сравнения
- Добавляют разрезающий агент — химической или ферментативной природы. Разрезающий агент случайным образом вносит разрывы в ДНК. Условия реакции подбирают таким образом, чтобы каждая цепочка ДНК была разрезана лишь в одном месте. Белок, который специфически связывается с последовательностью нуклеотидов ДНК, защищает участок связывания от разрезания.
- Продукты деградации ДНК разделяют при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Фрагменты ДНК, с которыми не был связан белок будут разрезаны в случайных местах и в геле будут распределяться в виде «лестницы». Фрагменты ДНК, с которыми связывается белок, будут защищены от разрещания и будут образовывать отпечаток, след на такой «лестнице». Одновременно с футпринтингом может быть произведено секвенирование ДНК методом Максама-Гилберта, при этом будет установлена последовательность нуклеотидов, с которыми связывается соответствующий белок.
Мечение
Анализируемые молекулы ДНК могут быть помечены отдельно с 3' и с 5' конца, для определения расположения сайта связывания белка. Используют метки:
- Радиоактивные метки традиционно используют для мечения фрагментов ДНК для футпринтинга, данный способ мечения был разработан на методики секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту. Данный вариант является очень чувствительным, при помощи радиоактвной метки можно визуализировать малые количества ДНК.
- Флюоресцентные метки являются заменой опасным радиоактивным. Однако, флюоресцентное мечение является менее чувствительным методом визуализации ДНК, и низкие концентрации продуктов футпринтинга не могут быть детектированы. Для визуализации продуктов, меченных флюорофорами используют секвенирующие гели и методы капиллярного электрофореза.
Разрезающий агент
В качестве разрезающего агента для деградации исследуемой ДНК применяют ДНКазу I типа, реактив Фентона, ультрафиолетовое облучение.
Просмотров: 8894
|
|