Биология - Лактоферрин - Биологические функции
09 февраля 2011Оглавление:
1. Лактоферрин
2. Строение и физико-химические свойства
3. Биологические функции
4. Гены лактоферрина
5. Рецептор лактоферрина
Лактоферрин относится к системе врожденного иммунитета. Существуют данные о том, что лактоферрин опосредованно вовлечен в процессы клеточного иммунитета. Главные биологические функции белка — это связывание и транспорт ионов железа, но кроме этого лактоферрин обладает антибактериальной, антивирусной, антипаразитарной, различными каталитическими активностями, а также противораковым, антиаллергическим, иммуномоделирующим действиями и радиопротективными свойствами.
Антибактериальная активность
Наиболее изученным является механизм антибактериальной активности лактоферрина. Антибактериальные свойства белка обусловлены способностью лактоферрина связывать железо и тем самым лишать бактериальную микрофлору необходимого для ее роста и жизнедеятельности микроэлемента. Бактерицидные свойства белка также обусловлены наличием специфических лактоферриновых рецепторов на клеточной поверхности микроорганизмов. Показано, что лактоферрин связывается с липополисахаридами бактериальных стенок, и входящая в состав белка окисленная форма железа инициирует их перекисное окисление. Это приводит к изменению мембранной проницаемости и последующему лизису клеток.
Все вышеперечисленные механизмы антибактериального действия лактоферрина напрямую зависят от железосвязывающих свойств белка. Вместе с тем в основе антиинфекционной активности лактоферрина могут лежать и другие механизмы, не зависящие от способности белка связывать ионы железа, например стимулирующее действие лактоферрина на фагоцитоз и влияние на активность комплемента. Однако наиболее изученным механизмом антибактериального действия белка, не зависящим от его железосвязывающей способности, является специфическое взаимодействие лактоферрина с наружной бактериальной мембраной, которое приводит к гибели клеток бактерий. Было показано, что белок разрушает бактериальную мембрану и даже проникает внутрь клетки. За специфическое связывание с бактериальной стенкой ответственен лактоферрицин — пептид, расположенный на N-конце молекулы лактоферрина и получаемый in vitro протеолитическим расщеплением белка трипсином.
Антивирусная активность
Показано, что лактоферрин обладает антивирусной активностью против широкого спектра вирусов человека и животных с ДНК и РНК геномами. Лактоферрин связывает различные антигены вирусной природы преимущественно в условиях in vitro. На данный момент показано действие белка против вирусов простого герпеса 1 и 2, цитомегаловируса, ВИЧ,вируса гепатита С, хантавирусов, ротавирусов, полиовирусов первого типа, аденовирусов, респираторного синцитиального вируса, мышиного вируса лейкоза Френда.
Наиболее изученным механизмом антивирусной активности лактоферрина является предотвращение попадания вирусных частиц в клетки-мишени. Многие вирусы имеют тенденцию связываться с гепарансульфат-гликозоаминогликанами и липопротеинами мембран эукариотических клеток. После первоначального контакта с клеткой вирусная частица взаимодействует со специфическими вирусными рецепторами и проникает в клетку. Лактоферрин связывается с гепарансульфат-гликозоаминогликанами и липопротеинами на поверхности клеток, препятствуя тем самым связыванию с ними вирусных частиц и дальнейшему проникновению вируса в клетку. Интересно, что лактоферрицин, который обеспечивает основные антимикробные свойства лактоферрина, практически не проявляет антивирусной активности. Кроме того, апо-ЛФ в большинстве случаев показывает гораздо большее антивирусное действие, чем металлонасыщенный лактоферрин.
Помимо взаимодействия с клеточными рецепторами, лактоферрин напрямую связывается с вирусными частицами и препятствует их проникновению в клетки. Это подтверждается наличием антивирусного действия белка против ротавирусов, для которых клеточными рецепторами являются углеводные остатки, отличающиеся по составу от гликозаминогликанов. Кроме того, было показано взаимодействие лактоферрина с белками оболочки вируса гепатита. Последним моментом в развитии антивирусной активности белка является ингибирование вирусной репликации уже после попадания вируса в клетку. Такое непрямое противовирусное влияние осуществляется за счет регуляции синтеза натуральных киллеров, гранулоцитов и макрофагов -– клеток, которые играют решающую роль на ранних стадиях развития вирусной инфекции. Методами ПЦР в реальном времени и при помощи ДНК-микрочипов показано повышение экспрессии гена лактоферрина при тяжелом остром респираторном синдроме.
Антигрибковая активность
Показано, что лактоферрин и лактоферрицин ингибируют in vitro рост Trichophyton mentagrophytes, который вызывает ряд кожных заболеваний, например, стригущий лишай. Лактоферрин обладает активностью против Candida albicans -- симбионтов, образующих колонии в слизистой оболочке ротовой полости здоровых людей. Тем не менее, этот вид является основным грибковым патогеном у людей с оппортунистическими инфекциями ротовой полости и организма в целом, а также у иммуннодефицитных больных. Долгое время в качестве основного антигрибкового препарата против Candida albicans, использовали флюконазол, что привело к появлению штаммов, устойчивых к воздействию этого лекарства. Было показано, что лактоферрин в комплексе с флюконазолом обладает антигрибковой активностью против флюконазол-устойчивых штаммов Candida albicans, также других видов Candida: C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis и C. tropicalis. Антигрибковая активность наблюдается только в случае последовательной инкубации клеток Candida с лактоферрином, а потом с флюконазолом, но не наоборот. Лактоферрицин обладает антигрибковой активностью, превосходящей активность самого лактоферрина. В составе лактоферрицина изучали два пептида, содержащие 1-11 и 17-26 аминокислотные остатки лактоферрина. Синтетически синтезированный пептид 1-11 обладает гораздо большей активностью против Candida albicans, чем нативный ЛФ. Кроме того, показано, что пептид, содержащий 4-11 аминокислотные остатки, не вызывает гибели клеток Candida, что указывает на важность 1-4 аминокислот белка в проявления антигрибковой активности. Исследования синтетического пептида 17-26 показали, что он стимулирует образование гидроксильных радикалов мышиными нейтрофилами и в комбинации с антигрибковым препаратом амфотерицином В защищает животных от летальных для них инфекций Candida albicans и Aspergillus fumigatus в гораздо большей степени, чем амфотерицин В один. Причем in vitro антигрибковая активность пептида была в 10 раз ниже, чем активность амфотерицина В.
Оральное введение лактоферрина через питьевую воду мышам с ослабленным иммунитетом и симптомами стоматита приводило к значительному уменьшению числа Candida albicans в ротовой полости и размеров повреждения языка. Показано, что оральное введение лактоферрина уменьшает количество патогенных организмов в тканях, близких к желудочно-кишечному тракту у нескольких моделей инфицированных животных. Более того, ВИЧ-инфицированные больные с Candida albicans, устойчивые к антигрибковым препаратам, полностью избавлялись от грибковой инфекции после введения смеси, содержащей лактоферрин, лизоцим и интроаконазол.
В отличие от антивирусного и антибактериального действия лактоферрина, очень мало известно о противогрибковом механизме действия белка. Показано, что антигрибковая активность лактоферрина обеспечивается разрушением клеточной стенки и связыванием белка с плазматической мембраной C. albicans. Действие лактоферрина на C. albicans in vitro приводит к изменению мембранного потенциала и закислению цитоплазмы клеток Candida, что говорит о прямом или косвенном взаимодействии лактоферрина с плазматической мембраной.
Поскольку лактоферрин позволяет минимизировать концентрации лекарств, при которых происходит эффективное лечение грибковых инфекций, возможно его использование совместно с противогрибковыми препаратами в терапии заболеваний, вызываемых штаммами с лекарственной устойчивостью. Синергическое действие лактоферрина с антибиотиками, антигрибковыми и антибактериальными препаратами против патогенных микроорганизмов может быть очень эффективным. Кроме того, использование лактоферрина, который является одним из факторов неспецифической защиты в слюне, позволяет уменьшить распространение флюконазол-устойчивых видов Candida среди людей с ослабленной иммунной системой, в частности среди больных СПИДом.
Взаимодействие с нуклеиновыми кислотами
Взаимодействие белков c ДНК является объектом многочисленных исследований, направленных на рассмотрение механизмов, контролирующих экспрессию генов. Поэтому одним из важных свойств лактоферрина считают его способность связываться с нуклеиновыми кислотами. Обнаружено, что фракция белка, выделенного из молока, содержит 3.3 % РНК, кроме того, при взаимодействии с одноцепочечной и двуцепочечной ДНК белок предпочтительнее связывается с двуцепочечной ДНК. Взаимодействие лактоферрина с ДНК частично ингибировалось добавлением антител к ДНК, полученных из плазмы крови больных системной красной волчанкой.
Способность лактоферрина связывать ДНК активно используется многими исследователями для выделения и очистки белка с помощью аффинной хроматографии на колонках с иммобилизованными ДНК-содержащими сорбентами. Была предложена методика выделения лактоферрина из молочной плазмы на агарозе с иммобилизованной одноцепочечной ДНК. При выделении белка из мочи новорожденных на этом сорбенте было обнаружено, что при прохождении через желудочно-кишечный тракт кроме неповрежденного лактоферрина образуются два фрагмента 51 и 39 кДа, которые также связывают ДНК.
Ферментативные активности лактоферрина
Лактоферрин гидролизует РНК и проявляет свойства пиримидин-специфических секреторных рибонуклеаз.
Сравнительный анализ данных рентгеноструктурного анализа лактоферрина и комплекса РНКазы А с аналогом субстрата 2’-5’ CpG в совокупности с анализом гомологии первичной последовательности этих двух белков показал наличие в молекуле лакоферрина структурных мотивов, подобных активному центру белков суперсемейства РНКазы А. Используя метод молекулярного моделирования, был проведен анализ топографии потенциального активного центра лактоферрина по аналогии с таковым для РНКазы А. Кандидатами на роль ключевых аминокислотных остатков РНК-гидролизующего центра лактоферрина являются остатки аминокислот His-91, His-246 и Lys-237, которые находятся в оптимальной для катализа ориентации к другим ближайшим остаткам в возможном активном центре. Субстрат-связывающий участок образуют Asp-244, Lys-241 и Thr-90. Таким образом, потенциальный РНКазный центр лактоферрина расположен в междоменной области белка.
Способность лактоферрина гидролизовать РНК открывает еще один аспект функций белка в организме, так как показано, что РНКазы молока путем разрушения РНК-генома ингибируют обратную транскрипцию ретровирусов, вызывающих рак молочной железы у мышей. Было показано, что у женщин группы Парси в Западной Индии уровень РНКаз молока заметно ниже такового в остальных группах, а частота заболеваемости раком молочной железы превышает в три раза среднестатистическую заболеваемость. Таким образом, можно предположить, что РНКазы молока и лактоферрин в частности играют важную роль в патогенезе заболеваний, вызываемых различными ретровирусами.
Также было показано, что изоформы лактоферрина обладают нуклеазными и фосфатазными активностями. Гидролиз олигодезоксирибонуклеотидов лактоферрином протекал значительно медленнее, чем высокомолекулярных ДНК-субстратов. Исследуемая фракция белка не содержала ионов железа. Оптимальное значение pH реакционной смеси при гидролизе ДНК оценено близким 7.0-7.5. Эта величина значительно превышает значение рН оптимума других известных ДНКаз. Кроме того по таким свойствам, как активация каталитической функции низкомолекулярными эффекторами и ионами металлов, лактоферрин существенно отличается от других ферментов с ДНКазной активностью.
Была показана нуклеотид-гидролизующая активность препаратов лактоферрина. Лактоферрину, помимо АТРазной активности, принадлежит активность, отщепляющая фосфатную группу от любых рибо- и дезоксирибонуклеозид- моно-, ди- и трифосфатов. Лактоферрин обладает свойствами неспецифической нуклеозид-5’-моно-, ди- и трифосфатфосфатазы, которую назвали нуклеотидфосфатазой. При этом скорости дефосфорилирования нуклеотидов ниже, чем для классических АТРаз и нуклеозидаз, но сравнимы с таковыми или даже выше, чем для других широко распространенных ферментов, типа эндонуклеаз рестрикции. Показано, что АТР-гидролизующая активность является железонезависимым свойством белка, а конформационные перестройки, вызванные координацией ионов железа, не влияют на АТРазный центр молекулы.
Показано, что не разделенные на изоформы препараты лактоферрина разных доноров гидролизовали только 4,6-этилиден-п-нитрофенил--a,D-мальтогептаозид, но не другие олигосахариды с иными связями между моносахаридными остатками. Препараты лактоферрина катализировали гидролиз мальтогептаозида с Km = мМ. В целом эта величина Km для мальтогептаозида сопоставима или даже выше, чем таковые для α-амилазы и каталитически активных антител молока и крови больных аутоиммунными заболеваниями.
Просмотров: 15507
|
|