Биология - Метод ДНК-комет - Постановка метода

08 февраля 2011


Оглавление:
1. Метод ДНК-комет
2. Постановка метода



Проводиться иммобилизация, подвергнутых воздействию изучаемого фактора клеток в низкоплавкой агарозе, нанесенной на предметное стекло для микроскопии. Обработка образцов в буфере с высоким содержанием соли приводит к лизису клеточных мембран и экстракции белков. Молекулы ДНК разделяют электрофорезом, треки ДНК визуализируют посредством окрашивания флуоресцентным красителем, после чего образцы изучают микроскопически. При наличии разрывов ДНК нарушается структурная организация хроматина и утрачивается сверхспирализация ДНК, что приводит к релаксации этой биомакромолекулы, формируются фрагменты ДНК, не связанные с клеткой. В электрическом поле релаксированные петли и фрагменты ДНК вытягиваются по направлению к аноду, что и придает наблюдаемым объектам вид «комет». Количество ДНК, мигрировавшей по направлению к аноду и определяемое микрофотометром, может использоваться в качестве показателя, характеризующего уровень повреждений ДНК в изучаемых клетках. «Кометы» анализируют либо путем визуального наблюдения и дифференциации «комет» по степени поврежденности ДНК, либо с использованием компьютерных программных средств обработки изображений. Последний метод анализа «комет» особенно необходим для объективной оценки влияния небольшой концентрации повреждающего агента, или для выявления незначительных различий между субпопуляциями клеток .

Стандартизация метода

В настоящее время большинство лабораторий, внедривших данный методологический подход в исследования, разработали многочисленные вариации протокола, в частности продолжительности и условий лизиса клеток, денатурации, электрофореза и окрашивания ДНК. Подсчитывают 25-500 клеток на одном стекле в двух повторах. Результаты эксперимента являются достоверными при повторении не менее 6 раз. Анализ ДНК-комет может проводиться визуально или с помощью программно-аппаратного комплекса. При визуальном анализе ДНК-кометы ранжируют на пять условных типов с соответствующим числовым значением от 0 до 4.

Расчет индексов

Обозначение Характеристика Расчёт
\mathsf \mbox{I}_\mbox{dc}

Индекс ДНК-comet

\mathsf \mbox{I}_\mbox{dc} — Степень поврежденности ДНК
Индекс ДНК-комет — рассчитывается
как отношение суммы «ДНК—комет» каждого типа,
к общей сумме подсчитанных «ДНК-комет».
\mathsf \mbox{I}_\mbox{dc}=\frac{}\Sigma

, где n0 − n4 — число «ДНК-комет» каждого типа, а
Σ — сумма подсчитанных «ДНК-комет».

Программы для работы с изображением и анализа

  • CometScore - бесплатная программа для полуавтоматических расчетов показателей ДНК-комет, совместима с Windows 5 и 6.
  • CaspLab — GPL software.
  • Коммерческая программа — listed by Comet Assay Interest Group


Просмотров: 10841


<<< Метод Бредфорда
Метод доминантных летальных мутаций у Drosophila melanogaster >>>