Биология - Проточная цитометрия

08 февраля 2011
Самая актуальная информация бесконтактная мойка робот на нашем сайте.




Проточная цитометрия

Проточная цитометрия является современной технологией быстрого оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.

Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Образцы для проточной цитометрии

  • кровь
  • костный мозг
  • ликвор
  • суставная жидкость
  • плевральная жидкость
  • асцитическая жидкость
  • суспензированные клетки тканей

Принцип метода

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

  • рассеяние света под малыми углами.
  • рассеяние света под углом 90°.
  • интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.

Наиболее часто используемые флуорохромы

  • Флуоресцеина изотиоцианат
  • Фикоэритрин
  • Перидинин-Хлорофилл Протеин
  • Алофикоцианин

Тандемные красители:

  • Фикоэритрин — Техасский красный
  • Фикоэритрин — Cy5
  • Фикоэритрин — Cy7
  • Аллофикоцианин- Cy7

"Квантовые точки" QD560, QD590 и т.д.

Преимущества метода

  • короткое время анализа за счет высокой скорости
  • анализ большого количества клеток
  • логические ограничения допускают детектирование субпопуляций клеток
  • измерение параметров редко встречающихся клеток
  • объективное измерение интенсивности флуоресценции

Область применения

Иммунология

  • иммунофенотипирование клеток периферической крови
  • определение фагоцитарной активности
  • определение внутриклеточных цитокинов
  • определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов
  • определение пролиферативной активности
  • исследование клеточного цикла
  • оценка клеточной цитотоксичности

Онкология

  • количественный анализ внутриклеточных компонентов
  • анализ стадий клеточного цикла
  • выявление анеуплоидного клона
  • определение пролиферативной активности анеуплоидного клона
  • определение специфических маркеров
  • позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска
  • оценка состояния иммунной системы:
  • оценка клеточного звена иммунитета
  • оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток

Цитология

  • определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток
  • оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов
  • определение экспрессии поверхностных антигенов
  • анализ стадий клеточного цикла
  • измерение физиологических параметров клетки

Гематология

  • анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови
  • подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам
  • дифференциальная диагностика лимфопролиферативных заболеваний и реактивных лимфоцитозов
  • диагностика лимфопролиферативных заболеваний
  • диагностика острых лейкозов
  • оценка минимальной резидуальной болезни

Фармакология

  • измерение экспрессии маркеров
  • измерение активности внутриклеточных ферментов
  • определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне

В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах, определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100—1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови. При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом.

Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т. п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.

Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов. Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.



Просмотров: 11464


<<< Опыты Г. Шапошникова по искусственной эволюции