Биология

Биология - Азотобактер - Биологические свойства

Морфология

Клетки представителей рода Azotobacter: видны палочковидные и кокковидные клетки различного размера, окраска железным гематоксилином по Гейденгайну, × 1000

Клетки бактерий рода Azotobacter относительно крупные, обычно овальные, но обладают плеоморфизмом, то есть могут иметь разную форму — от палочковидной до сферической. На микроскопических препаратах клетки могут располагаться одиночно, парами, неправильными скоплениями или, изредка, цепочками различной длины. Формируют особые покоящиеся формы — цисты, не образуют спор.

В свежих культурах клетки подвижны за счёт многочисленных жгутиков. В более поздних культурах клетки теряют подвижность, приобретают почти кокковидную форму и продуцируют толстый слой слизи, формирующий капсулу клетки. На форму клетки также оказывает влияние химический состав питательной среды — пептон, например, вызывает плеоморфизм и, в том числе, индуцирует образование так называемых «грибоподобных» клеток. Индуцирующее влияние на плеоморфизм в культурах представителей рода азотобактер в составе пептона оказывает аминокислота глицин.

При микроскопии в клетках наблюдаются включения, часть из которых окрашивается, а часть остаётся бесцветными. В начале XX века считалось, что прокрашиваемые включения являются «репродуктивными гранулами», или гонидиями, и принимают участие в размножении клетки, являясь своеобразными «зародышевыми» клетками, однако затем было доказано, что гранулы не принимают участия в размножении клеток и не являются «малыми, коккоподобными репродуктивными клетками» бактерий — гонидиями. Прокрашиваемые гранулы состоят из волютина, неокрашивающиеся же гранулы являются каплями жира. Гранулы являются резервным источником питания.

Цисты

Циста представителей рода Azotobacter: видно центральное тело с вакуолями и многослойная оболочка

Цисты представителей рода Azotobacter более устойчивы к действию неблагоприятных факторов внешней среды, чем вегетативные клетки — так, цисты в два раза более устойчивы к действию ультрафиолетового излучения чем вегетативные клетки, устойчивы к высушиванию, гамма-излучению, солнечной иррадиации, действию ультразвука, однако не являются устойчивыми к действию высоких температур.

Формирование цист индуцируется изменением концентрации питательных веществ в питательной среде и добавлением некоторых органических веществ. Цисты редко образуются в жидких питательных средах. Инцистирование может быть индуцированно химическими факторами и сопровождается метаболическими сдвигами, изменениями в катаболизме и дыхании, изменениями в биосинтезе макромолекул. Определённое значение в индукции инцистирования имеет альдегиддегидрогеназа, а также регулятор ответа AlgR.

Циста азотобактера — сферическое тело, состоящее из так называемого центрального тела: уменьшенной копии вегетативной клетки с большим количеством вакуолей, и двуслойной оболочки, внутренняя часть которой называется интима и имеет волокнистое строение, а внешняя называется экзина и представлена ровной, отражающей структурой, имеющей гексагональное кристаллическое строение. Экзина частично гидролизуется трипсином и устойчива к действию лизоцима, в отличие от центрального тела. Центральное тело может быть изолированно в жизнеспособном состоянии некоторыми хелатирующими агентами. Главными компонентами внешней оболочки цисты являются алкилрезорцинолы, состоящие из длинных алифатических цепей и ароматических колец. Алкилрезорцинолы встречаются также у других бактерий, животных и растений.

Прорастание цист

Циста представителей рода Azotobacter является покоящейся формой вегетативной клетки, необходимой для переживания неблагоприятных факторов внешней среды, и не служит для размножения. После возобновления оптимальных условий, таких, как оптимальное значение pH, температуры и поступления доступного источника углерода цисты прорастают, образовавшаяся вегетативная клетка вновь размножается путём простого деления клетки. При прорастании цист экзина цисты повреждается, и высвобождается большая вегетативная клетка.

Микроскопически первым проявлением прорастания спор является постепенным понижением преломления света цистами при фазово-контрастной микроскопии. Прорастание цист — медленный процесс и длится около 4—6 часов, на протяжении которых центральное тело увеличивается и происходит захват гранул волютина, прежде находившихся в интиме. Затем экзина лопается и вегетативная клетка высвобождается из экзины, имеющей характерную подковообразную форму. При прорастании цисты отмечаются метаболические изменения. Сразу после прибавления источника углерода к среде цисты начинают поглощать кислород и выделять двуокись углерода, скорость дыхания повышается до максимальных значений через 4 часа после прибавления глюкозы. Синтез белков и РНК также начинается после прибавления источника углерода к среде, однако интенсификация синтеза макромолекул отмечается лишь через 5 часов после прибавления источника углерода. Синтез ДНК и фиксация азота инициируются через 5 часов после прибавления глюкозы к безазотистой питательной среде.

Во время прорастания цист отмечаются изменения в интиме, видимые на электронно-микроскопических препаратах. Интима состоит из углеводов, липидов и белков и занимает почти такой же объём в клетке, что и центральное тело. Во время прорастания цист интима гидролизируется и используется клеткой для синтеза компонентов клетки.

Физиологические свойства

Получают энергию в ходе окислительно-восстановительных реакций, используя в качестве донора электоронов органические соединения. Для роста необходим кислород, но способны расти при пониженных концентрациях кислорода, образуют каталазу и оксидазу. Способны использовать различные углеводы, спирты и соли органических кислот в качестве источников углерода. Азотфиксаторы способны фиксировать по крайней мере 10 мкг азота на грамм потреблённой глюкозы, фиксация азота зависит от наличия ионов молибдена, отсутствие молибдена может быть частично замещено ионами ванадия. В качестве источников азота могут использовать нитраты, ионы аммония и аминокислоты. Оптимум pH для роста и фиксации азота 7,0—7,5, способны расти в диапазоне pH от 4,8 до 8,5. Возможен также зависимый от водорода миксотрофный рост представителей рода Azotobacter на безазотистой питательной среде, содержащей маннозу. Водород доступен в почве, поэтому не исключена возможность миксотрофии у представителей рода Azotobacter в природных условиях.

Культуральные свойства

Представители рода Azotobacter способны использовать углеводы, спирты и соли органических кислот, в том числе и бензоаты, в качестве источника углерода и энергии. Представители рода растут на безазотистых средах, предназначенных для выделения свободноживущих азотфиксирующих и олигонитрофильных организмов, например на среде Эшби, содержащей источник углерода и необходимые микроэлементы, или на среде М. В. Фёдорова, содержащей больше микроэлементов, а также на жидкой среде Бейеринка.

На плотных питательных средах представители рода образуют плоские, слизистые колонии пастообразной консистенции диаметром 5—10 мм, в жидких питательных средах образуют плёнки. Характерно также пигментирование, колонии представителей рода могут быть окрашены в тёмно-коричневый, зелёный и других цветов, или же могут быть бесцветными в зависимости от видовой принадлежности. Представители рода Azotobacter являются мезофильными микроорганизмами и растут при температуре 20—30 °C.

Пигменты

Представители рода Azotobacter продуцируют пигменты. Например, типовой вид рода Azotobacter chroococcum продуцирует тёмно-коричневый водорастворимый пигмент меланин. Продукция меланина у Azotobacter chroococcum наблюдается при высоких уровнях дыхания во время фиксации азота и, предположительно, также защищает нитрогеназную систему от действия кислорода при аэроадаптации Другие виды рода Azotobacter также продуцируют пигменты от жёлто-зелёного до пурпурного цвета. Также представители рода способны продуцировать зеленоватый флюоресцирующий пигмент, флюоресцирующий жёлто-зелёным светом и пигмент, флюоресцирующий бело-голубым светом.

Геном

Частично завершено определение нуклеотидной последовательности хромосомы Azotobacter vinelandii штамма AvOP. Хромосома Azotobacter vinelandii — кольцевая молекула ДНК размером 5 342 073 пар нуклеотидов и содержит 5043 генов, из которых 4988 кодируют белки, доля Г+Ц пар составляет 65 моль %. Отмечено изменение плоидности представителей рода Azotobacter на протяжении жизненного цикла: по мере старения культур количество хромосом в клетках и содержание ДНК увеличивается — в стационарной фазе роста культуры могут содержать более 100 копий хромосомы на клетку. При пересеве на свежую питательную среду первоначальное содержание ДНК восстанавливается Кроме хромосомальной ДНК, у представителей рода Azotobacter обнаружены плазмиды, доказана и возможность трансформации представителей рода Azotobacter экзогенной плазмидной ДНК.