Биология - Пиросеквенирование
09 февраля 2011Оглавление:
1. Пиросеквенирование
2. Коммерциализация
Пиросеквенирование это метод секвенирования ДНК, основанный на принципе «секвенирование путем синтеза». При включении нуклеотида происходит детекция высвобождающихся пирофосфатов. Технология была разработана Полом Ниреном и его студентом Мустафой Ронаги, в Королевском Техническом Институте в 1996 году.
Процедура
"Секвенирование путем синтеза" заключается в том, что для секвенирования одноцепочечной ДНК ферментативно синтезируют комплементарную цепочку. Метод пиросеквенирования основан на детекции активности фермента ДНК-полимеразы с другим хемилюминесцентным ферментом. Метод позволяет секвенировать одну цепочку нуклеотидов ДНК путем синтеза комплементарной цепочки, при этом регистрируется присоединение каждого нуклеотида. Матрица ДНК иммобилизована, растворы нуклеотидов A, C, G и T добавляются и отмываются последовательно после реакции. Свет образуется в тот момент, когда раствор нуклеотидов соответствует первому неспаренному основанию матрицы. Последовательность растворов, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность матрицы.
Матрица одноцепочечной ДНК гибридизуется с праймером и инкубируется с ферментами ДНК-полимеразой, АТФ-сульфурилазой, люциферазой и апиразой, а также с субстратами аденозин-5´-фосфосульфатами и люциферином.
- Добавление одного из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов инициирует следующий этап. ДНК-полимераза включает правильный комплементарный дезокси-нуклеотид в цепочку. При этом стехиометрически высвобождается пирофосфат.
- Фермент АТФ-сульфурилаза количественно превращает PPi в аденозинтрифосфат в присутствии аденозин-5´-фосфосульфата. АТФ выступает "топливом" для фермента люциферазы, которая превращает люциферин в оксилюциферин, при этом высвобождается видимый свет, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшегося АТФ, Свет образуется в реакции, катализируемой люциферазой, регистрируется камерой и далее анализируется специальной компьютерной программой.
- Невключенные нуклеотиды и АТФ подвергаются деградации ферментом апиразой, и реакция начинается с новым нуклеотидом.
В настоящий момент, существуют некоторые ограничения в применения данного способа секвенирования. Лимитирующим фактором является длина последовательности нуклеотидов, которая составляет около 300-500 нуклеотидов, что короче, чем 800-1000 нуклеотидов, достижимые методом обрыва цепи. Такие ограничения могут затруднять секвенирование геномов, в частности, богатых повторенными последовательностями нуклеотидов. К 2007 году, пиросеквенирование обычно использовали для повторного секвенирования или секвенирования геномов, для которых известна последовательность нуклеотидов родственного вида.
Просмотров: 10349
|
|