Биология - Вестерн блоттинг - Детекция

09 февраля 2011


Оглавление:
1. Вестерн блоттинг
2. Подготовка образца
3. Гель-электрофорез
4. Перенос на мембрану
5. Блокирование
6. Детекция
7. Анализ
8. Протоколы



Во время процесса детекции мембрана «метится» исследуемым белком с модифицированным антителом, которое связано с репортёрным ферментом, который выдерживается на соответствующей подложке, приводя к колориметрической реакции и давая цвет. В силу различных причин, детекция проводится в два этапа, хотя сейчас доступен одношаговый метод детекции для определенных областей применения.

Антитела вырабатывают, воздействуя на класс хозяйских или на культуру иммунных клеток некоторым белком.Обычно это часть иммунного ответа, а здесь собранные антитела используются как специфичный и чувствительный инструмент детекции, который напрямую связывается с белком.

После блокирования разведенный раствор первичных антител инкубируется с мембраной и слегка встряхивается. Обычно раствор состоит из забуференного раствора соли с небольшим процентным содержанием детергента, иногда с сухим молоком или BSA. Раствор антител и мембрана могут быть вместе закрыты и инкубированы где угодно от 30 минут до оставления на ночь. Также они могут быть инкубированы при различных температурах, при повышенной температуре наблюдается лучшее связывание — и специфичное и неспецифичное.

После полоскания мембраны для удаления несвязавшихся первичных антител, мембрану выдерживают в других антителах, напрямую связывающихся с класс-специфическими участками первичных антител. Они известны как вторичные антитела и в соответствии с их целевыми свойствами, как правило называются по типу «anti-mouse», «anti-goat», и так далее. Антитела получают из животного источника; анти-мышиные вторичные антитела будут связываться с большинством первичных антител, полученных из мышей. Это создает некоторую экономию, позволяя отдельной лаборатории использовать один источник массового производства антител, и ведет к намного более воспроизводимым результатам. Вторичные антитела обычно связывают с биотином или с репортёрным ферментом, таким как щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена. Это значит, что несколько вторичных антител могут связываться с одним первичным и усиливать сигнал.

Наиболее распространенные, связанные с пероксидазой хрена вторичные антитела используются для разрезания хемилюминесцентного агента, и продукт реакции производит люминесцентное излучение пропорционально количеству белка. Лист светочувствительной фотографической пленки помещается напротив мембраны и подвергается действию излучения реакции, создавая изображение полос антител на блоте. Более дешевый, но менее чувствительный подход с использованием 4-хлоронафтольного окрашивания в смеси с 1 % перекисью водорода; реакция пероксидного радикала с 4-хлоронафтолом дает темно-коричневое окрашивание, которое регистрируется без использования специальной фотографической пленки.

Как и в методиках ELISPOT и ELISA, фермент может обеспечиваться молекулой субстрата, которая превращается ферментом в цветной продукт реакции, а он будет виден на мембране.

Другой метод детекции вторичными антителами использует антитела со связанным флюорофором, который излучает в ближней инфракрасной области. Свет, излучаемый флюоресцентным красителем, постоянен и делает флюоресцентную детекцию более точным и чувствительным способом измерения разницы в сигнале, производимом белками, которые мечены антителами, на вестерн блоте. Белки могут быть определены количественно, так как сигнал рассчитывается как разница по отношению ко всем белкам на мембране, измеренном в покое, к хемилюминесценции, которая измеряется в динамике.

Третий альтернативный метод использует радиоактивную метку вместо фермента, связанного с вторичным антителом, такую как меченный антитело-связывающий белок типа Белка А Staphylococcus с радиоактивным изотопом йода. Другие методы безопаснее, быстрее и дешевле, поэтому радиоактивная детекция используется редко.

Исторически процесс нанесения меток проводится в два этапа, потому что относительно проще произвести первичные и вторичные антитела в раздельных процессах. Это дает исследователям и компаниям огромные преимущества в плане гибкости, и добавляет шаг амплификации в процесс детекции. Учитывая появление высоко-пропускного анализа белка и низкий порог обнаружения, все же наблюдается интерес к развитию системы-в-один-шаг для нанесения меток, которая позволяет процессу проходить быстрее и с меньшими затратами. Она требует антител-меток, которые распознавали бы исследуемый белок и одновременно несли маркер для детекции — метки, наиболее доступные для известных «белковых хвостов». Сначала метки инкубируют с мембраной в стиле метода-в-два-шага с первичными антителами, а затем они готовы для прямой детекции после серии промывок.



Просмотров: 20557


<<< Вектор (биология)
Генная пушка >>>